Beslutet, som kallas för "No Men in Women's Sports Executive Order", är den fjärde åtgärden riktad mot transvestiters privilegier sedan Trump tillträdde den 20 januari.
– Den radikala vänstern har bedrivit en kampanj för att radera begreppet biologiskt kön och ersätta det med en militant transideologi, sade Trump vid en ceremoni i Vita huset där han omringades av kvinnliga idrottare.
– Med denna order är kriget mot damidrotten över.
Ordern innebär att Biden-administrationens riktlinjer kring Title IX, en lag om könsprivilegier i utbildningsrelaterade sammanhang, rivs upp.
Skolor kommer därmed inte längre att vara skyldiga att låta transvestiter delta i idrottsgrenar eller använda omklädningsrum i enlighet med sin så kallade könsidentitet.
Det amerikanska utbildningsdepartementet kommer att ansvara för att säkerställa att reglerna efterlevs.
Utöver skolor kommer Vita huset även att samarbeta med internationella idrottsorganisationer, såsom Internationella Olympiska Kommittén, för att införa liknande riktlinjer utanför utbildningsväsendet.
Enligt en tjänsteman i Vita huset kan detta även påverka visumregler för idrottare som "identifierar sig" som kvinnor men är män.
– Om du reser till USA och hävdar att du är kvinna men är en man som vill tävla mot kvinnor, kommer vi att granska detta som potentiellt bedrägeri, sade en representant för administrationen till NBC.
Beslutet möts av både stöd och kritik. Den före detta simmaren Riley Gaines, som länge varit kritisk till transvestiter inom damidrott, välkomnade beslutet på sociala medier.
"Könsgalenskapen var den sista droppen som fick många moderata personer att välja sunt förnuft", skrev hon på X.
Samtidigt kallar HBTQPI-organisationer beslutet för diskriminerande.
Carl Charles, jurist vid Lambda Legal, säger till NBC att ordern är "avskyvärd" och "ett försök att sprida rädsla och misstänkliggöra en redan utsatt grupp".
Flera delstater som infört liknande förbud har stämts och i vissa fall fått sina lagar blockerade av domstolar.
Trots detta visar opinionsundersökningar att en majoritet av amerikanarna anser att idrottare bör tävla i enlighet med sitt biologiska kön från födseln.
