Stämningen lämnades in under onsdagen i delstaten Delaware i USA, rapporterar France24.
Enligt presidentparets advokat Tom Clare har det rört sig om ett sista steg efter ett års resultatlösa försök att få Candace Owens att dra tillbaka sina påståenden.
– Varje gång vi försökt uppmana henne att göra det rätta, att tala sanning och sluta sprida dessa lögner, har hon i stället hånat paret Macron och våra försök. Nu är det nog, säger Clare i en intervju med CNN.
I stämningsansökan redovisas enligt honom till slut "omfattande bevisning" för att Brigitte Macron "föddes som kvinna och alltid har varit kvinna".
Advokaten varnar samtidigt för att skadeståndet som kommer att yrkas vid rättegången blir betydande om Owens fortsätter med anklagelserna.
– Om hon fortsätter att trappa upp mellan nu och rättegången kommer beloppet bli stort, hotar han.
Presidentparet Macron har varit gifta sedan 2007. De träffades enligt den officiella historien när Emmanuel Macron var gymnasieelev och den 24 år äldre Brigitte, då med efternamnet Auzière, arbetade som lärare. Hon var då gift och hade tre barn, men skilde sig senare och paret gifte sig efter att Emmanuel flyttat till Paris.
Élyséepalatset har inte kommenterat stämningen.
